[13: ヒト患者のサンプル解析]

■それから、もう一つアディポネクチンに関係する話をすると−−このあたりが我々の研究の醍醐味だと思って頂ければいいんですが−−多くの研究者がマウスから出発し、細胞から出発しています。我々もそういう研究もやってますが、我々は最終的にはヒトの病気の原因を解明し、治療法予防法を開発したいと考えている以上、常に困難はあっても、インフォームド・コンセントの下にヒトの患者のサンプルを解析しているんですね。

○はい。

■どういうことをやっているかというと、どういう遺伝子多型が日本人の糖尿病を起こす遺伝子多型か。先ほどお話をしましたＰＰＡＲγの遺伝子多型で、プロリン型は日本人の９６％持っているものは糖尿病を起こしやすい遺伝子多型ですが、それは日本人の糖尿病の２，３％しか説明できないのです。
　なぜかというと、大部分が糖尿病を起こしやすいタイプなので、糖尿病を起こす起こさないの差をなかなか、説明できない。

○ええ。

■そういうアプローチをですね、マウスで見つかった鍵分子を候補遺伝子として、ヒトで多型を見つけるというのが一つの定石なんですけども、もう一つ、非常に困難ではあっても、いま非常に色んなところでブレイクスルーが起こっているのは「全ゲノム解析」なんです。我々は８，９年かかって、日本人の２型糖尿病の患者さん、我々のところに通ってくる患者さんにインフォームドコンセントのもとにですね、罹患同胞対（シブペア）を集めるという解析をしたんです。

○ええ。

■なかなか大変でしてね、まず糖尿病の兄弟の方がいるかどうか聞いて、シブペア解析によって日本人の糖尿病の遺伝子が分かれば、糖尿病の予防や治療に応用できるという話をして、そしてご本人の採血をさせてもらうだけではなくて、その方のご兄弟の採血もさせてもらいます。
　そうすると、兄弟で同じ病院に来ているということは、まずないんですね。

○そうでしょうね。

■それこそ、北は北海道から南は九州まで、いろんな病院に通っている。そうすると、まず患者さんから兄弟の方に研究内容を説明して頂いて、インフォームド・コンセントを得たのちにですね、その係り付けの先生にお手紙を書いて、その先生に採血して頂いて、こちらにサンプルを送ってもらうわけです。それを全部で２２４組の患者さんのご協力を頂いて、５年近くかかってそういうサンプルを集めたんですね。

○ふーむ。

■これ、基礎の研究者には絶対にできないことだと思うんですね。それで何をやるかというと、「罹患同胞対法（シブペア・アナリシス）」っていうんですけど、糖尿病の遺伝子解析がなぜ難しいかというと、多因子だからですね。多因子病は連鎖解析では見つからない。そこで用いられてきたのが罹患同胞対法で、糖尿病の兄弟にまずご協力を頂く。そして全ゲノムの４００のマーカーについてタイピングをするんです。

○はいはい。

■そうすると例えば、あるマーカーについて、ABCDという４つの種類が区別されると しますね。

○はい。

■両親が、それぞれＡとＢ、ＣとＤを持っているとすると、兄弟の第一子は、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤという４通り。弟も４通りですね。

○ええ。

■そうすると兄がたとえば、ＡＣを持っていると。弟はＡＣを持っている場合もあるし、ＡＤを持っている場合もあるし、ＢＣ、ＢＤの可能性がある。
　すると、ＡＣとＡＣは二つとも一致。ＡＣとＡＤは一つ一致。ＡＣとＢＣも一つ一致。ＡＣとＢＤは一個も一致しない。つまり、その場合には、二個一致が一通り、一個一致が二通り、０個一致が二通り。今度は発端者がＡＣじゃなくてＡＤの組み合わせもありますから、全部で１６通りあるんです。そのうち４通りは二個とも一致しない、４通りは二個とも一致する。８通りは一個だけ一致すると分類するんです。

○はい。

■これはね、当該マーカーが糖尿病とまったく関係しない場合１：２：１で分布するんです。分かりますね？
　ところがですね、そのマーカーがもし糖尿病と関係しているとですね、糖尿病の兄弟をサンプルとして集めているので、一致率がランダムチャンスよりも少し高くなるんです。逆にいうと、その兄弟が、１シブペアであればそんなものは関係ない。でも二百数十のペアを集めると、統計学的に、有意になってくるんですね。この方法はいろんなマーカーを、お互いにインディペンデントに解析できるので、多因子病の解析にすごく有利なんですね。それから遺伝形式によらないですね。兄弟の糖尿病をとってくるという前提ですから。それからある遺伝子があっても病気にならないとか、そういう浸透率が低いとかも関係ない。糖尿病になったものだけを集めてくるから。罹患同胞対を用いた全ゲノムマッピングは、その当時ものすごくテクニカルにチャレンジングでした。
　我々はどうしたかというと、フランスのパスツール研究所に共同研究を申し込んだんですね。しかもＤＮＡを渡したのではなかなか我々の思ったようなペースで解析もできないだろうと。それで二人行ってもらって、３年がかりでジェノタイプの解析を行って、昨年発表することができたんです。

○

■そうすると日本人の糖尿病に関係する遺伝子領域は、染色体上の９カ所にマッピングされたと。一つ一つの領域にはまだ１００ないし２００個くらいの遺伝子があるんだけど、その９カ所の領域のうち、３カ所が欧米人のマッピングの結果と一致していたんですね。だから人種を越える糖尿病因子はそこだろうと。
　残りの６カ所は、日本人やアジア人に特有の領域じゃないかと我々は思っているんですね。

○うーん、なるほど。

■で、それぞれの領域のなかで、１００個ないし２００個の遺伝子があるので、どれが日本人の糖尿病の遺伝子かというのを探しているんですよ。
　そこで非常に、我々が、マウスの実験、細胞の実験に加えて、ヒトの遺伝学的研究をやっていたことの強みが現れました。

○どんなことですか。

■先ほどマウスの実験からアディポネクチンがインスリン感受性を亢進させるアディポサイトカインであることを発表したのが２００１年の８月なんですけども、ちょうどそのときに、ゲノムのマッピングのデータも得られていたので、アディポネクチンの遺伝子がどこにあるのか探したら、ちょうど我々が、日本人の糖尿病の遺伝子として領域を決めたその中にあったんです。

○なるほど。

■つまりインスリン感受性に非常にメジャーな影響をもたらす分子の遺伝子の場所が、日本人の糖尿病遺伝子が存在する領域にあったということは、ただちに、次のようなことを意味するんですね。
　アディポネクチンの遺伝子のなかにタイプがあって、そのタイプによってインスリン抵抗性になったりインスリン感受性になったりして、２型糖尿病の遺伝的感受性に影響をもたらしているんじゃないかと考えたわけです。

○ふむふむ。

■そこで１５人のかたに協力して頂いて、一人は二つのアリルを持ってますから、３０の遺伝子、アディポネクチンの１万６０００塩基対の配列を全部決めてやると、１０カ所のタイプがあったんですね。１万６０００分の１０です。
　そして、そのうちの一つのイントロンのなかにあるＳＮＰで、ＧかＴかという多型で、ＧＧとＧＴとＴＴの３つの遺伝子型で、ＧＧ型をもっているとＴＴ型に比べるとアディポネクチンの血中濃度が２／３になるという多型を見つけたんです。

○イントロンのなかの多型でも、そんなに差が出るんですか。

■イントロンのなかの多型は、まったく発現に影響を及ぼさないものもあれば、イントロンのなかにあっても、遺伝子の発現に影響を及ぼすものもあるとされているんですね。特に第一イントロンとか第２イントロンとかは転写因子が結合してエンハンサー活性を持つということが知られていて、今回のもそれに相当するんじゃないかと我々は思っているんだけど、もう一つの可能性もありますね。別のプロモーター領域の、発現を変えるＳＮＰと、いわゆる連鎖不平衡の関係にあるマーカーである可能性もあるんですよね。
　いずれにせよ、ＧＧタイプ、両親からＧＧを受け継いでいると、血中アディポネクチン・レベルが生まれつき２／３に低下しているということです。そういう人のインスリン抵抗性を調べると−−もともと臨床サンプルですから、見ることができるわけです−−あるいは糖尿病と、非糖尿病患者におけるＧＧタイプの頻度の差を見ると、ＧＧタイプを持っていると血中アディポネクチン濃度は２／３、インスリン抵抗性が２〜３割上昇していて、糖尿病のなりやすさが２倍以上になるということが分かったんです。

○なるほど。アディポネクチンの発現に日本人のなかで差があるということは分かりました。人種差はあるんですか？　それともタイプの問題なのか？

■アディポネクチンの発現はですね、体重を揃えると人種差はそれほどないと思うんですね。ＧＧタイプがどれだけあるかということと、どれだけ太っているかということで決まると思うんですけども、ＧＧタイプを日本人の５０％は持っているということは、我々の半分がアディポネクチンを出しにくく、糖尿病になりやすいのではないかということが言えます。
　そうするとですね、日本人の持っている５０％のタイプが糖尿病になりやすいということは、population attributable risk、人種におけるＳＮＰの糖尿病に関係する遺伝子の寄与を計算できます。そうすると、ＰＰＡＲγの場合は２０人に一人しかいいタイプを持っていないわけど、今度のアディポネクチンの場合は半々に別れるわけです。しかもこっち持ってる人はこっち持ってない人に比べて、２倍、糖尿病リスクが違うとなるとかなり影響があって、１５％の糖尿病の素因を計算できるという結果になったんですね。

○なるほど。

■いまのところ、はっきりと日本人の糖尿病多型だと分かっているのはアディポネクチンとＰＰＡＲγに加えて膵β細胞から分泌されるアシリンの遺伝子多型の３つだけだと思うんだけど、つまり、私が申し上げたかったのは、ヒトのgeneticsな研究と、マウスの発生工学的な研究ですね、そういうもの、あるいはゲノム研究と発現解析、機能解析というものが、うまく照らし合わされて、糖尿病の原因が突き止められるんじゃないかということですね。
　マウスの実験だけではダメだし、ヒトのゲノムのマッピングだけからでも、なかなかそううまくいかないし、やっぱり、いまある生物学ないし医学の知識をフルに活用しようとすると、そういうアプローチでいいんではないか。少なくとも我々は臨床で患者さんを診ていてコンタクトもあるし、臨床症状も知っているので、そういうアプローチを常にやってきたのは非常に良かったのではないかと思っています。